Fernando Galán Galán

Profesor Titular de Medicina
Especialista en Medicina Interna
Experto en Miopatía Mitocondrial del Adulto
Fibromialgía y Síndrome de Fatiga crónica
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BASE GENÉTICA DE 3 ENFERMEDADES MITOCONDRIALES IDENTIFICADAS A TRAVÉS DE UN NUEVO ENFOQUE DIAGNÓSTICO. 2022

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Nuevo enfoque diagnóstico a través de la tecnología CRISPR-Cas9 eliminando genes individuales de una línea celular HAP1 humana y utilizando análisis multiómicos (proteómica) basados en espectrometría de masas.

La proteómica cuantitativa proporciona datos funcionales valiosos que pueden agregarse al cuerpo de evidencia necesario para confirmar la patogenicidad de una nueva variante en casos de enfermedades mitocondriales y no diagnosticadas a largo plazo. Nuestros esfuerzos actuales ahora se centran en desarrollar un pipeline (pipeline es un modelo informatico para investigacion genética) de proteómica cuantitativa robusta y de alto rendimiento para incorporarla a las investigaciones clínicas de rutina de pacientes con enfermedades mitocondriales sospechadas pero no diagnosticadas para disminuir la brecha diagnóstica actual.

 El Genoma de las mitocondrias en humanos codifica solo 13 proteínas, las proteínas restantes que componen las mitocondrias están codificadas por genes que se han transferido o añadido al núcleo a lo largo de más de mil millones de años de evolución. Cientos de estas proteínas permanecen pobremente caracterizadas o completamente sin caracterizar. Esta importante brecha de conocimiento ha limitado la comprensión básica de la función mitocondrial y ha obstaculizado los esfuerzos para diagnosticar y tratar las enfermedades mitocondriales.

  • La enfermedad mitocondrial puede ser causada por un defecto en cualquiera de las 1.150 proteínas estimadas que componen las mitocondrias, lo que a menudo dificulta la identificación de la proteína defectuosa y el tratamiento de la afección
  • Los esfuerzos pioneros en las últimas décadas han relacionado su disfunción con más de 150 enfermedades mitocondriales  distintas. Aún así, cientos de proteínas mitocondriales carecen de funciones claras, y la base genética subyacente de aproximadamente el 40 % de los trastornos mitocondriales, sigue sin resolverse.
  • La enfermedad mitocondrial puede causar una amplia gama de síntomas, como crecimiento deficiente, debilidad muscular, convulsiones, discapacidades cognitivas y del desarrollo y problemas de visión.
  • El mayor reconocimiento de un espectro más amplio de manifestaciones más allá de los síndromes clínicos definidos clásicamente, se refleja en que actualmente la forma de presentación más común es la MULTISISTÉMICA, en las pautas actualizadas de la atención clínica basadas en el consenso de expertos.
  • Las características clínicas específicas pueden sugerir Enfermedad mitocondrial, especialmente cuando se agrupan en combinaciones particulares que definen síndromes recurrentes y reconocibles, a los que nos referimos como síndromes mitocondriales clásicos (por ejemplo, síndrome de Leigh, encefalomiopatía mitocondrial, acidosis láctica y episodios similares a accidentes cerebrovasculares (MELAS), o Epilepsia mioclónica con fibras rojas irregulares (MERRF).Sin embargo, muchos trastornos mitocondriales manifiestan fenotipos multisistémicos que no se ajustan a un síndrome mitocondrial clásico
  • Ninguno de los criterios de enfermedad mitocondrial puede ser perfectos, porque pueden tener síntomas y signos superpuestos.
  • Dado que no se dan criterios mínimos y ningún paciente individual tendría todos los criterios, el diagnóstico depende en gran medida del análisis subjetivo y la experiencia, que varían ampliamente entre los médicos.
  • En un sentido práctico, ningún criterio para el diagnóstico de la enfermedad mitocondrial puede captar a todos los pacientes con esa enfermedad, simplemente debido a la expresividad variable y la penetrancia incompleta característica de prácticamente todas las enfermedades mitocondriales.
  • Es importante enfatizar que los criterios diagnósticos actuales no están destinados a diagnósticos clínicos, sino que están destinados a ser utilizados para la clasificación de pacientes en estudios de investigación

COMPRENDIENDO MEJOR LA FUNCIÓN DE CADA PROTEINA: en cualquiera de las 1.150 proteínas estimadas que componen las mitocondrias

La nueva comprensión de cómo los cientos de proteínas de las mitocondrias trabajan juntas para generar energía y realizar otras funciones ofrece un camino prometedor para diagnosticar y tratar mejor la enfermedad mitocondrial.

Ahora, los científicos han desarrollado un nuevo enfoque que les permite comprender mejor el papel de cada proteína y lo han utilizado con éxito para identificar la causa genética de tres nuevas enfermedades mitocondriales.

El primero fue la identificación de un paciente con signos claros del trastorno pero sin mutaciones en los genes sospechosos habituales. Los investigadores identificaron un nuevo gen en la vía OXPHOS (fosforilación oxidativa) y demostraron que el paciente portaba una mutación en la proteína PIGY del gen PYURF. Utilizando la proteómica, descubrieron que PYURF, un gen codificador de proteínas, es importante en la función mitocondrial y se altera en las enfermedades humanas. Específicamente, revelaron que PYURF es una chaperona de metiltransferasa dependiente de SAM que respalda tanto el ensamblaje del complejo I como la biosíntesis de la coenzima Q y cuando se interrumpe origina un trastorno mitocondrial multisistémico previamente desconocido.

El segundo. Los investigadores demostraron que otra mutación en RAB5IF era responsable de un caso de displasia cerebrofaciotorácica y dos casos de labio hendido en una familiaSe descubrió que mediante la inactivación mediada por CRISPR-Cas9 eliminando el gen RAB5IF, eliminó  también una proteína codificada por un gen diferente, TMCO1, que se ha relacionado con la displasia cerebrofaciotorácica, una patología caracterizada por rasgos faciales distintivos y discapacidad intelectual grave. La afección se caracteriza por rasgos faciales distintivos y discapacidad intelectual grave. En colaboración con el coautor Nurten Akarsu, PhD, profesor de genética humana en la Universidad Hacettepe en Ankara, Turquía, los investigadores demostraron que una mutación en RAB5IF fue responsable de un caso de displasia cerebrofaciotorácica y dos casos de labio hendido en una familia turca. 

Un tercer gen C2orf69, su inactivación mediada por CRISPR-Cas9, provocó problemas con el almacenamiento de azúcar, lo que contribuyó a un síndrome autoinflamatorio fatal. La presentación clínica de este síndrome recientemente reconocido es de hecho una combinación singular de la enfermedad de almacenamiento de glucógeno tipo IV clínicamente heterogénea y una mitocondriopatía. Es un Sindrome  autosómico recesivo, que se caracteriza por defectos autoinmunes, retraso en el crecimiento, neurodegeneración progresiva del sistema nervioso central y muerte prematura. Los datos sobre ese síndrome se publicaron en el año 2021 en un artículo dirigido por Bruno Reversade, PhD, de A*STAR, la Agencia de Ciencia, Tecnología e Investigación de Singapur.

NUEVO ENFOQUE DIAGNÓSTICO

Los investigadores utilizaron la tecnología CRISPR-Cas9 para eliminar genes individuales de una línea celular humana. El procedimiento creó un conjunto de líneas celulares relacionadas, cada una derivada de la misma línea celular original pero con un solo gen eliminado. Los genes eliminados codificaban 50 proteínas mitocondriales de función desconocida y 66 proteínas mitocondriales de función conocida.

Luego, examinaron cada línea celular en busca de pistas sobre el papel que normalmente juega cada gen faltante para mantener las mitocondrias funcionando correctamente. Los investigadores monitorearon las tasas de crecimiento de las células y cuantificaron los niveles de 8.433 proteínas, 3.563 lípidos y 218 metabolitos para cada línea celular. Utilizaron los datos para construir la aplicación MITOMICS (CRISPR multiómica de proteína huérfana mitocondrial), equipándola con herramientas para analizar e identificar los procesos biológicos que fallaron cuando una proteína específica desapareció.

Después de validar el enfoque con proteínas mitocondriales de función conocida, los investigadores propusieron posibles roles biológicos para muchas proteínas mitocondriales de función desconocida. Con más investigación, pudieron vincular tres proteínas a tres enfermedades  mitocondriales separadas

Nuestros datos, que se pueden explorar a través del recurso interactivo en línea MITOMICS.app, sugieren roles biológicos para muchas otras proteínas mitocondriales huérfanas que aún carecen de una caracterización funcional sólida y definen una rica firma celular de disfunción mitocondrial que puede respaldar el diagnóstico genético de enfermedades mitocondriales.

CONCLUSIONES

  1. Un paciente con signos claros Enfermedad mitocondrial multisistémica pero sin un diagnóstico genético después de examinar todos los genes de enfermedades conocidas. Usando este nuevo enfoque, los investigadores pudieron identificar un gen nuevo PYURF en la vía OXPHOS (fosforilación oxidativa) y demostrar que el paciente portaba un cambio genético responsable de sus problemas clínicos
  2. RAB5IF era responsable de un caso de displasia cerebrofaciotorácica y dos casos de labio hendido en una familia.
  3. Un tercer gen C2orf69, su inactivación mediada por CRISPR-Cas9, provocó problemas con el almacenamiento de azúcar, lo que contribuyó a un síndrome autoinflamatorio fatal

REFERENCIAS

  1. Rensvold, J. W., Shishkova, E., Sverchkov, Y., Miller, I. J., Cetinkaya, A., Pyle, A., Manicki, M., Brademan, D. R., Alanay, Y., Raiman, J., Jochem, A., Hutchins, P. D., Peters, S. R., Linke, V., Overmyer, K. A., Salome, A. Z., Hebert, A. S., Vincent, C. E., Kwiecien, N. W., Rush, M., … Pagliarini, D. J. (2022). Defining mitochondrial protein functions through deep multiomic profiling. Nature, 606(7913), 382–388. https://doi.org/10.1038/s41586-022-04765-3
  2. Wong HH, Seet SH, Maier M, Gurel A, Traspas RM, Lee C, Zhang S, Talim B, Loh AYT, Chia CY, Teoh TS, Sng D, Rensvold J, Unal S, Shishkova E, Cepni E, Nathan FM, Sirota FL, Liang C, Yarali N, Simsek-Kiper PO, Mitani T, Ceylaner S, Arman-Bilir O, Mbarek H, Gumruk F, Efthymiou S, Uğurlu Çi Men D, Georgiadou D, Sotiropoulou K, Houlden H, Paul F, Pehlivan D, Lainé C, Chai G, Ali NA, Choo SC, Keng SS, Boisson B, Yılmaz E, Xue S, Coon JJ, Ly TTN, Gilani N, Hasbini D, Kayserili H, Zaki MS, Isfort RJ, Ordonez N, Tripolszki K, Bauer P, Rezaei N, Seyedpour S, Khotaei GT, Bascom CC, Maroofian R, Chaabouni M, Alsubhi A, Eyaid W, Işıkay S, Gleeson JG, Lupski JR, Casanova JL, Pagliarini DJ, Akarsu NA, Maurer-Stroh S, Cetinkaya A, Bertoli-Avella A, Mathuru AS, Ho L, Bard FA, Reversade B. Loss of C2orf69 defines a fatal autoinflammatory syndrome in humans and zebrafish that evokes a glycogen-storage-associated mitochondriopathy. Am J Hum Genet. 2021 Jul 1;108(7):1301-1317. doi: 10.1016/j.ajhg.2021.05.003. Epub 2021 May 25. Erratum in: Am J Hum Genet. 2021 Jul 1;108(7):1356. PMID: 34038740; PMCID: PMC8322802.

PROF. DR. FERNANDO GALAN

APÉNDICE: CASO SIN DIAGNÓSTICO GENÉTICO

El equipo del profesor Taylor en Newcastle identificó a un paciente con signos claros de enfermedad mitocondrial pero sin un diagnóstico genético después de examinar todos los genes de enfermedades conocidas. Usando este nuevo enfoque, los investigadores pudieron identificar un gen nuevo PYURF en la vía OXPHOS (fosforilación oxidativa) y demostrar que el paciente portaba un cambio genético dañino responsable de sus problemas clínicos.

Identificamos a un niño nacido de padres consanguíneos, primos hermanos, que presentó al nacer acidosis metabólica profunda. Las características clínicas incluyeron hipotonía muscular, retraso en el crecimiento, retraso en el desarrollo, atrofia óptica, niveles persistentemente elevados de lactato en la sangre y el líquido cefalorraquídeo, y sustancia blanca cerebelosa anormal y atrofia cerebelosa en imágenes de resonancia magnética.

  • Utilizando la proteómica, descubrieron que PYURF, un gen codificador de proteínas, es importante en la función mitocondrial y se altera en las enfermedades humanas. Específicamente, revelaron que PYURF es una chaperona de metiltransferasa dependiente de SAM que respalda tanto el ensamblaje del complejo I como la biosíntesis de la coenzima Q y se interrumpe en un trastorno mitocondrial multisistémico previamente no resuelto.

Para determinar la etiología genética precisa, realizamos una secuenciación imparcial del exoma completo. Priorizamos las variantes exónicas (codificación) o del sitio de empalme con una frecuencia de alelo menor (MAF) ≤0.01 que se predijo que serían patógenas según las herramientas in silico. Nuestro análisis de variantes autosómicas recesivas en genes nucleares que codifican proteínas mitocondriales indicó una variante homocigótica de cambio de marco en el segundo exón de PYURF (GenBank, NM_032906.4) como la única causa genética candidata concebible: c.289_290dup (p.Gln97Hisfs*6); esta variante estaba presente en un alelo (MAF=0,000006287) en la base de datos de agregación del genoma (gnomAD). La secuenciación de Sanger demostró claramente la segregación con la enfermedad clínica en la familia

En ausencia de células del paciente, diseñamos esta mutación en células HAP1 para probar si la variante PYURF codificada es suficiente para interrumpir los procesos relacionados con CoQ y CI. Las células que albergaban la mutación reflejaban estrechamente la línea PYURFKO, con una pérdida sustancial de proteínas relacionadas con CoQ y CI. Finalmente, purificamos la versión mutante de PYURF, que exhibió una afinidad de unión marcadamente reducida por AF5. Aunque no se disponía de la línea celular del paciente necesaria para asignar definitivamente la patogenicidad, el deterioro de los procesos de CI y CoQ en las células que albergan esta variante específica de PYURF con pérdida de función, proporciona una base molecular para los fenotipos celulares observados.