Nuevas preguntas y desafíos con respecto a este nuevo virus. ¿Cuándo hacer la prueba? ¿A quién probar? ¿Qué probar? ¿Con qué frecuencia hacer la prueba? ¿Y qué hacer con los resultados de la prueba?

Hay dos categorías amplias de pruebas de SARS-CoV-2:

• las que detectan el virus en sí
• y las que detectan la respuesta del huésped al virus.

Pruebas que detectan el virus en sí.  Hipotéticamente, si la población del mundo entero pudiera analizarse de una vez , con una prueba que proporcionara 100% de especificidad y sensibilidad (poco realista, obviamente), podríamos identificar a todas las personas infectadas y clasificar a las personas en aquellos que en ese momento estaban asintomática, mínimamente / moderadamente sintomática y severamente sintomática. El asintomático y el sintomático mínimo / moderado podrían ser puestos en cuarentena para evitar la propagación del virus, y los síntomas severamente manejados y aislados en entornos de atención médica. El rastreo del contrato podría llevarse a cabo para encontrar a aquellos en riesgo de estar en el período de incubación en virtud de su exposición.

Alternativamente, la prueba de una respuesta del huésped, si, nuevamente, la prueba fuera hipotéticamente 100% sensible y específica, podría identificar a aquellos expuestos previamente al virus y (si supiéramos que esto es cierto, lo que no sabemos) etiquetar a aquellos que son inmunes para el virus, que podría ser aprovechado para trabajar en entornos donde individuos potencialmente infectados (por ejemplo, pacientes enfermos en hospitales) podrían presentar un riesgo. Desafortunadamente, estos escenarios hipotéticos no son realidad. Sin embargo, con esta situación ideal como guía, lo que tenemos disponible como prueba hoy en día debe considerarse cuidadosamente en términos de cómo pueden aprovecharse para acercar la crisis actual a la situación ideal, especialmente en ausencia de terapias o vacunas.

La función de la FDA no es desarrollar pruebas o decidir qué pruebas usa un profesional de la salud. Nuestra función es determinar si las pruebas desarrolladas por otros brindan resultados precisos y confiables, incluso cuando algunos prefieran que dejemos las pruebas en el mercado sin evidencia de que funcionen. Los resultados falsos también pueden contribuir a la propagación de COVID-19. Queremos que nuestros tratamientos sean probados para su efectividad y revisados por la FDA. Queremos lo mismo para nuestras pruebas: garantías de que son precisas y efectivas

Cronología del soporte de la FDA para desarrolladores de pruebas:

Desde principios de enero, la FDA ha trabajado con más de 230 desarrolladores de pruebas que tienen o se espera que presenten solicitudes de autorización de emergencia de la FDA para sus pruebas. Hasta la fecha, se han otorgado 20 autorizaciones.

Las pruebas de laboratorio para la enfermedad por coronavirus respiratorio 2019 (COVID-19) incluyen métodos que detectan la presencia de virus y aquellos que detectan anticuerpos producidos en respuesta a la infección. La detección de anticuerpos (serología) se puede utilizar tanto para fines clínicos como para vigilancia de la población

 

 

PRUEBAS DIAGNÓSTICAs DE INFECCIÓN POR SARS-CoV-2/COVID-19 Y SU POTENCIAL USO

Tipo de prueba	Qué miden	Valora	Beneficiarios
ARN viral a través de la amplificación de ácido nucleico, generalmente usando PCR.	infección actual con SARS-CoV-2.	Informar a la persona sobre el estado infeccioso. Informa del manejo del paciente y las acciones necesarias para prevenir la transmisión.	Personas. Asistencia sanitaria o centros de atención a largo plazo. Salud pública.
Detección de anticuerpos.	Exposición previa al SARS-CoV-2.	Detectar personas susceptibles (anticuerpos negativos) y aquellas previamente infectadas. Identificar personas con anticuerpos neutralizantes Facilitar el seguimiento de contactos y la vigilancia.	Identificar aquellos potencialmente inmunes a SARS-CoV-2. Si las pruebas pueden detectar inmunidad protectora, las personas podrían volver a trabajar Centros de salud; terapia experimental. Salud pública.

PRUEBAS DE ARN VIRAL

La mayoría de las pruebas utilizadas actualmente para la detección directa del SARS-CoV-2 identifican el ARN viral a través de la amplificación del  ácido nucleico, generalmente mediante PCR. Las pruebas que detectan ARN viral dependen del ARN viral presente en la muestra recolectada. Los tipos de muestra más comunes que se analizan son los hisopos tomados de la nasofaringe y / o la orofaringe, y el primero se considera algo más sensible que el segundo. Sí se recogen ambos, los dos hisopos se pueden combinar y probar simultáneamente en una sola reacción para ahorrar reactivos.

Después de la recolección, los hisopos se colocan en un líquido para liberar el virus / ARN viral de los hisopos en solución. Luego, el ARN viral se extrae de esa solución y posteriormente se amplifica (por ejemplo, por  transcripción inversa-PCR).

El ARN, que es parte de la partícula del virus, se extrae y se convierte en ADN complementario – mediante la transcriptasa inversa - para su análisis. La prueba de PCR implica secuencias de unión en el ADN que solo se encuentran en el virus y que copian repetidamente todo lo que está en el medio. Este proceso se repite muchas veces, con la duplicación de la región objetivo con cada ciclo. Cuando se produce la amplificación, se crea una señal fluorescente, y una vez que la señal alcanza un umbral, el resultado de la prueba se considera positivo. Si no hay una secuencia viral presente, no se producirá amplificación, lo que dará como resultado un resultado negativo.

Pasos en la prueba de RT-PCR: a) Se toma una muestra de la nariz o garganta de la persona; b) Se extrae ARN. c) se transcribe en ADN complementario (ADNc), d) Una vez que los cebadores se han unido al ADN, proporcionan un punto de partida para la ADN polimerasa para ayudar a copiarla. La ADN polimerasa degrada la sonda unida, lo que da como resultado un aumento de la señal de fluorescencia, e) La fluorescencia aumenta a medida que se hacen copias del ADN del virus. Si el nivel de fluorescencia cruza cierto umbral, la prueba es positiva.

Para los pacientes con neumonía, además de las secreciones nasofaríngeas y orales, se analizan las secreciones del tracto respiratorio inferior, como el esputo y el líquido de lavado broncoalveolar. No debe suponerse que cada uno de estos (por ejemplo, muestra de torunda nasofaríngea, esputo, líquido de lavado broncoalveolar) tendrá la misma posibilidad de detectar el SARS-CoV-2; las tasas de detección en cada tipo de muestra varían de paciente a paciente y pueden cambiar en el curso de las enfermedades de los pacientes individuales. Algunos pacientes con neumonía pueden tener muestras nasales u orofaríngeas negativas pero muestras positivas de vías aéreas inferiores.

Si alguien cumple con la definición del caso pero la primera muestra (del tracto respiratorio superior) es negativa, ¿cuándo se debe tomar la segunda muestra: un día después? ¿Dos días después? ¿O dependiendo de la condición clínica del paciente?

Se sugiere que las pruebas se realicen con uno o dos días de diferencia. Sí la muestra del tracto respiratorio superior es negativa, se deben recolectar diferentes tipos de muestras, particularmente del tracto respiratorio inferior.

• Por lo tanto, una prueba negativa no niega la posibilidad de que un individuo esté infectado.
• Sin embargo, si la prueba es positiva, lo más probable es que el resultado sea correcto, aunque se está recogiendo RNA viral que hace su camino en el proceso de la prueba (por ejemplo, como la muestra o como resultado de la muestra de la contaminación cruzada o las pruebas realizadas por un trabajador de laboratorio que está infectado con SARS-CoV-2 [estos son solo algunos ejemplos]) posiblemente podría dar como resultado un resultado falso positivo.
• Además, observamos que el ARN viral no equivale a virus vivos y, por lo tanto, la detección de ARN viral no significa necesariamente que el virus pueda transmitirse desde ese paciente.

Las pruebas virales basadas en ARN son las mejores pruebas que tenemos en el contexto de una enfermedad aguda.

• Es importante reconocer que la precisión de la prueba se ve afectada por la calidad de la muestra y, por lo tanto, es fundamental que la muestra se obtenga de manera adecuada (y segura).
• La evaluación de pacientes con SARS-CoV-2 ayuda a identificar a aquellos que están infectados, lo cual es útil para el manejo individual del paciente, así como para la implementación de estrategias de mitigación para prevenir la propagación tanto en los centros de atención médica como en la comunidad.

Se debe considerar evaluar a cualquier persona que tenga síntomas compatibles con COVID-19, ya que las pruebas amplias ayudarán a definir quién tiene esta infección, permitiendo el control de su propagación.

Dado que el SARS-CoV-2 puede infectar a cualquiera y provocar la transmisión antes del inicio de los síntomas o incluso posiblemente sin que las personas desarrollen síntomas, incluso podría considerarse la posibilidad de realizar pruebas a pacientes asintomáticos. Desafortunadamente, se sabe poco en este momento sobre la detección de ARN viral en pacientes asintomáticos, y tales estrategias de prueba pueden extender los recursos disponibles más allá de los límites realistas. Algunas terapias futuras pueden funcionar mejor si se administran temprano, lo que exigirá pruebas tempranas de SARS-CoV-2 para lograr la máxima eficacia.

• Las preguntas sobre cuántas pruebas se necesitan y qué tipo se deben realizar en pacientes individuales (para el diagnóstico primario si los resultados de las pruebas iniciales son negativas y posteriormente documentar la eliminación del virus para liberar a los pacientes del aislamiento) permanecen abiertas.

La medición de los niveles virales también puede ser útil para controlar la recuperación, la respuesta a la terapia y / o el nivel de infectividad. Las pruebas de diagnóstico actuales basadas en ARN son principalmente cualitativas, y aunque podrían calibrarse para proporcionar cargas virales, actualmente no existe un proceso estandarizado. Es de destacar que no existe un umbral establecido para la interpretación de las cargas virales, que pueden variar en diferentes huéspedes.

• Los valores del umbral medio del ciclo de todos los tipos de muestras fueron más de 30 (2.6 × 10⁴ copias / ml) excepto para los hisopos nasales con un valor umbral medio del ciclo de 24.3 (1.4 × 10⁶ copias / ml), lo que indica mayores cargas virales
• Los valores del umbral del ciclo (Ct) de rRT-PCR se convirtieron en el número de copia de ARN del SARS-CoV-2. El límite de detección de la reacción de PCR cuantitativa fue de 2.690 copias /ml.
• Los valores de Ct están inversamente relacionados con el número de copias de ARN viral, con valores de Ct de 30.76, 27.67, 24.56 y 21.48 correspondientes a 1.5 × 10⁴, 1.5 × 10⁵, 1.5 × 10⁶ y 1.5 × 10⁷ copias por mililitro. Las muestras negativas se denotan con un Ct de 40, que era el límite de detección.

SEROLOGÍA. detectan la respuesta del huésped al virus

La otra categoría amplia de pruebas son aquellas que detectan IgM, IgA, IgG o anticuerpos totales (generalmente en sangre). El desarrollo de una respuesta de anticuerpos a la infección puede depender del huésped y tomar tiempo.

En el caso del SARS-CoV-2, los primeros estudios sugieren que la mayoría de los pacientes se seroconvierten entre 7 y 11 días después de la exposición al virus, aunque algunos pacientes pueden desarrollar anticuerpos antes.

• Como resultado de este retraso natural, la prueba de anticuerpos no es útil en el contexto de una enfermedad aguda.
• No sabemos con certeza si las personas infectadas con SARS-CoV-2 que posteriormente se recuperan estarán protegidas, total o parcialmente, de una infección futura con SARS-CoV-2 o cuánto tiempo puede durar la inmunidad protectora
• La evidencia reciente de un estudio de macaco rhesus sugiere inmunidad protectora después de la resolución de una infección primaria.

Las pruebas de anticuerpos para el SARS-CoV-2 pueden facilitar

1. el rastreo de contactos; las pruebas basadas en ARN también pueden ayudar con esto;
2. vigilancia serológica a nivel local, regional, estatal y nacional;
3. identificación de aquellos que ya han tenido el virus y por lo tanto pueden (si hay inmunidad protectora) ser inmunes.

Suponiendo que haya inmunidad protectora, la información serológica se puede usar para guiar las decisiones de regreso al trabajo, incluso para las personas que trabajan en entornos donde pueden volver a exponerse al SARS-CoV-2 (por ejemplo, personal sanitario).

• Las pruebas serológicas también pueden ser útiles para identificar personas que pueden ser una fuente de anticuerpos neutralizadores terapéuticos o profilácticos (actualmente experimentales).
• Además, las pruebas de anticuerpos se pueden usar en estudios de investigación para determinar la sensibilidad de los ensayos de PCR para detectar infecciones y se pueden emplear de forma retrospectiva para determinar el verdadero alcance de la pandemia y ayudar en el cálculo de las estadísticas, incluida la tasa de letalidad.
• Finalmente, las pruebas serológicas posiblemente se pueden usar para diagnosticar a los individuos con ARN viral negativo que se presentan tarde en su enfermedad.

Pico ARN viral aproximadamente a los 4 días del comienzo de los síntomas y puede ser positivo hasta el día 12.

Seroconversión entre 7 y 11 días después de la exposición al virus.

Jiangsu Medomics Medical Technologies (Nanjing, China). Kit de prueba rápida combinada de anticuerpos IgM / IgG SARS-CoV-2. Inmunoensayo de 15 minutos de flujo lateral que detecta anticuerpos IgM e IgG dirigidos contra SARS-CoV-2

Pharmact (Berlín). Prueba rápida de SARS-COV-2. Prueba POC de 20 minutos para detectar la exposición al SARS-CoV-2 mediante la identificación de anticuerpos IgG e IgM. Marcado CE y envío

Un inmunoensayo de 20 minutos que contiene tres antígenos SARS-CoV-2: la proteína N y los dominios S1 y S2 de la proteína S. Está diseñado para detectar cualquier anticuerpo del paciente que reconozca estas estructuras de proteínas.

• falsos negativos: 11%
• Falsos positivos: 9%

¿Qué me dicen los resultados?

Son posibles un total de tres líneas de detección, y la línea de control (C)

1. Resultado negativo: si solo aparece la línea de control de calidad (C) y las líneas de detección G y M no son visibles, entonces no se ha detectado un nuevo anticuerpo de coronavirus y el resultado es negativo.
2. Resultado positivo, solo M: si aparecen tanto la línea de control de calidad (C) como la línea de detección M, entonces se ha detectado el nuevo anticuerpo IgM de coronavirus y el resultado es positivo para el anticuerpo IgM.
3. Resultado positivo, solo G: si aparecen tanto la línea de control de calidad (C) como la línea de detección G, se ha detectado el nuevo anticuerpo IgG de coronavirus y el resultado es positivo para el anticuerpo IgG.
4. Resultado positivo, G y M: si aparecen la línea de control de calidad (C) y ambas líneas de detección G y M, se detectaron los nuevos anticuerpos IgG e IgM de coronavirus y el resultado es positivo para los anticuerpos IgG e IgM.

A diferencia de las pruebas de RT-PCR que detectan infecciones en curso, las pruebas basadas en anticuerpos pueden determinar quién ha sido infectado, con o sin síntomas.

CONCLUSIONES

• Las pruebas virales basadas en ARN son las mejores pruebas que tenemos en el contexto de una enfermedad aguda.
• Una prueba de RT-PCR negativa no niega la posibilidad de que un individuo esté infectado.
• A diferencia de las pruebas de RT-PCR que detectan infecciones en curso, las pruebas basadas en anticuerpos pueden determinar quién ha sido infectado, con o sin síntomas.
• Las preguntas sobre cuántas pruebas se necesitan y qué tipo se deben realizar en pacientes individuales (para el diagnóstico primario si los resultados de las pruebas iniciales son negativas y posteriormente documentar la eliminación del virus para liberar a los pacientes del aislamiento) permanecen abiertas

REFERENCIAS

1. Wang W, Xu Y, Gao R, et al. Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens. JAMA 2020 11 de marzo. Doi: 10.1001 / jama.2020.3786
2. Patel R, Babady E, Theel ES, et al. Report from the American Society for Microbiology COVID-19 International Summit, 23 March 2020: Value of Diagnostic Testing for SARS-CoV-2/COVID-19. 2020 Mar 26;11(2). pii: e00722-20. doi: 10.1128/mBio.00722-20.
3. Thevarajan, I., Nguyen, T.H.O., Koutsakos, M. et al. Breadth of concomitant immune responses prior to patient recovery: a case report of non-severe COVID-19. Nat Med (2020). https://doi.org/10.1038/s41591-020-0819-2
4. Holshue ML, DeBolt C, Lindquist S. et al. First Case of 2019 Novel Coronavirus in the United States. N Engl J Med. 2020 Mar 5;382(10):929-936. doi: 10.1056/NEJMoa2001191.

RESUMEN Y COMENTARIOS

PROF. DR. FERNANDO GALAN